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派森诺生物助您打造真菌“近完成图”

作者:上海派森诺生物科技股份有限公司 2016-06-29T17:56 (访问量:2266)

派森诺生物打造真菌近完成图

小编最近吃不好,睡不着,原因是小编遇到了一个头疼的项目。有客户想对20Kb左右的片段进行测序,根据该片段可区分不同的基因型,小编思考后觉得小case。小编根据参考序列将20Kb 片段分成6段,每段3 Kb左右来设计引物,打算进行PCR扩增后测序拼接。但在扩增中却遇到了问题,我们共设计了4轮引物,依然无法扩增得到部分目的条带,小编的内心受到了一万点伤害。究其原因,是因为客户提供的参考基因组采用短片段的二代测序拼接得到,尽管最终的拼接结果达到了染色体级别,但是碰巧客户想要研究的这一段区域因为结构比较复杂,导致拼接结果千疮百孔根本没法用这时小编在想,如果有一个接近于完成图的基因组那该有多好啊!!

小编相信,我遇到的问题很多老师也遇到过。如果老师您也遇到类似问题,又想根源上解决这个问题,那么您就来对地方了。小编所在的公司在前期经过大量的文献调研,实验方案设计优化、拼接参数优化,最终总结出一整方案,采用这套方案,我们拼接得到了一个真正的接近完成图的真菌。今天小编就大家分享我们完成的两个真菌基因组的成果

案例一:20M真菌基因组测序

小编要给大家分享的第一个真菌,其基因组大小为20Mb,但客户经费有限,针对该客户的具体情况我们设计构建三个不同插入片段大小的文库,分别为400 bp、5 kb和10 kb具体方案见表一

表一 20 M真菌基因组方案

二代短插入片段的测序数据进行 17-mer 分析,结果见图1,从这个图上可以看到这个基因组相对比较复杂,K-mer出现3 个峰,我们估算这个基因组大小为 28 M,见表二

表二 17-mer分析结果统计

图 1. 17-mer深度分布图

结合第二代和第三代测序的结果进行拼接,共得到140Contig,结果见表三,最长 Contig 的长度高达1.28 Mb,Contig N50 长度为570 Kb左右采用纯二代拼接得到的contig N50 为 117 kb即Contig N50 提升了 4.87倍

表三 20 M真菌基因组拼装的数据统计

案例二:30M真菌基因组测序

小编要和大家分享的第二个真菌,基因组大小为 30 Mb。根据之前的项目经验,结合客户的实际情况,我们设计构建了两个不同插入片段大小的文库,分别为400 bp、20 kb,具体方案见表四

表四 30 M 真菌基因组方案

对测序数据进行拼接组装,其结果给了我们很大惊喜,我们总共拼接得到12个contig序列,其中11条为染色体序列,1条为完整线粒体序列。由于,客户未对该真菌进行核型分析,我们无法判断这个基因组包含多少条染色体,但是根据经验以及拼接的效果,我们理由相信,这个真菌拼接到了近“完成图效果。

表五 30M真菌基因组拼装结果统计

图2 基因组圈图 图3 线粒体圈图

 

小结:

采用三代测序进行真菌基因组测序说难不难,说易不易。只有把每一个步骤做好,做扎实了,才能得到比较好的结果。小编的同事们从以下四个方面进行优化

l 实验设计方面,我们会根据您的基因组大小基因组复杂程度以及GC含量为您私人定制最合适的实验方案;

l 样品提取方面,我们独家研制出了针对不菌种的提取方法,且已申请**。和目前市面上试剂盒提取方法相比,该提取方法获得的DNA 在完整度、纯度方面更胜一筹

l 在建库方面,我们拥有Blue Pippin 全自动核酸片段回收系统可高效率自动化回收大片段,去除小片段DNA,确保得到超长片段的DNA,有利于后续的拼接分析;

l 在信息分析方面,我们采用多种算法进行混合拼接。

上述第一个方案三代测序构建的文库插入片段长度为10 Kb,第二个方案插入片段长度为20 kb,从拼接效果来看,第二个方案的效果要显著好于第一个方案,可拼接得到近“完成图”的效果,因此真菌基因组测序时小编更推荐大家采用20Kb的文库。我们公司目前正在同时做好几个 50 M左右的真菌的测序,一旦有结果,我们就会把我们的经验和大家做一个分享,而且我们也准备迎接接下来的挑战,在大型动植物基因组中构建长片段文库进行测序,也希望大家随时关注我们,和我们一起合作,打造属于老师您的完美基因组。

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