产品信息

产品描述

EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子中。Yefluor荧光染料分子很小，能够轻易地透过细胞膜，并迅速扩散细胞各处，通过染料和炔基产生的Click反应形成化学连接从而标记含炔基的核苷类似物如EdU，因而用于检测含炔基的核苷类似物。Yefluor 647 EdU染色试剂盒是包含了Yefluor系列荧光染料及相关缓冲液等的试剂盒，通过Yefluor染料检测EdU的掺入情况可说明细胞DNA的合成情况。

光谱特性：Yefluor 647 Azide：Ex/Em=650/670 nm；Hoechst 33342：Ex/Em= 350/461 nm,bound to DNA。

产品组分

注：上述反应次数是针对1 cm × 1 cm切片计算

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。20℃避光保存，有效期1年。

注意事项

本制品需与EdU产品配合使用。

操作时请采取防护措施，穿防护服、戴一次性手套等。

其他所需试剂

• 1× PBS（pH 7.2~7.6）

• 渗透剂（含0.5% Triton X-100 的PBS）

• 甘氨酸溶液（2 mg/mL）（去离子水配制）

• 组织及切片处理相关试剂（动物实验用）

使用说明

动物实验方法（以1 cm × 1 cm切片为例）

1．EdU 标记

1.1 动物EdU注射（具体参数可参考表2）：

1）注射方式：依据客户实验而定，如腹腔注射、皮下注射，肌肉注射、尾静脉注射等方式，其中以腹腔注射为多；

2）标记时间：最佳标记时间依据具体实验目的而定，小肠等增殖快的组织宜采用短时间标记；

3）标记浓度：最佳标记浓度依据具体标记时间而定，5 mg/kg剂量适合大部分实验；

4）取样部位：依据实验目的而定，一次标记可以对多种组织和器官切片，由于小肠上皮组织增殖较快，可以作为标记参考。

（注：建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况，小肠上皮组织细胞增殖速度快，成年小鼠EdU注射6 h后即可检测到阳性信息，可用作实验阳性对照进行预实验。）

2. 切片处理

2.1 切片前处理：组织器官最好进行清洗，以去除血液、组织或器官中残留的EdU，降低背景；

2.2 切片厚度：3 ~10 μm为宜，切片过厚可能影响切片背景；

2.3 切片后处理：

1) 石蜡切片脱蜡：二甲苯洗脱3次，10 min/次，乙醇梯度(100%，95%，85%，75%)洗脱各1次，去离子水洗脱1次；

2) 冰冻切片处理：室温放置30 min后，4℃丙酮固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min。

2.4  2 mg/mL甘氨酸清洗10 min；

2.5 （加强）加入100 μL渗透剂（0.5% Triton X-100的PBS）脱色摇床孵育10 min，PBS清洗。

3. EdU检测

注意：本参考步骤每个切片使用100 μL的Click-iT反应混合物。用户可根据自己样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。

3.1 准备1× Click-iT EdU 反应缓冲液（组分B）：10× 组分B试剂以去离子水稀释10倍即可。

3.2 制备一份5× 的Click-iT EdU反应添加物储液（组分D）：加0.3 mL去离子水至30 mg的D组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分D均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用）。

3.3 准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液（组分D）至1×，溶液应新鲜配置，当天用完。

3.4 依据表1准备Click-iT反应混合物。表1要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

表1  Click-iT反应混合物

3.5 去除促渗剂，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。

3.6 加入0.1 mL Click-iT反应混合物至每个切片，使反应液均匀覆盖样本。

3.7 室温避光孵育30 min