RNA提取实验常规样本采集(二) | RNA专题-技术前沿-资讯-生物在线

RNA提取实验常规样本采集(二) | RNA专题

作者:联川生物技术公司 2017-04-19T09:10 (访问量:7973)


一、常规样本——PAXgene Blood RNA Tube 采血

PAXgene Blood RNA Tube 采血

血液由血细胞和血浆组成,其中血细胞包括红细胞,血小板,白细胞;白细胞又包括粒细胞(酸性,中性,碱性粒细胞)和单个核细胞(淋巴细胞,单核细胞)

全血:是将人体内血液采集到采血管或采血袋内所形成的混合物 。

血液离体后血细胞内的RNA不稳定,采血后极易降解,而体外的基因诱导作用会使得转录组数目增加,体外RNA降解和基因诱导均可导致高估或低估体内转录组数目。

LC-Lab使用BD公司的PAXgeneTM Blood RNA Tube(以下称为PB采血管)采集全血,采集2.5ml血液/管。(PB采血管:内含稳定体内基因转录性状的添加剂,通过减少体外RNA降解,并将基因诱导减少到最小而发挥作用)

产品

货号

特征

采血量

PAXgeneTM Blood RNA Tube

762165

含有6.9ml添加剂

2.5ml

采集全血过程:

1、采血前,应将采血管恢复室温(一般PB采血管保存于室温或4℃,最高不超过40℃)

2、采血时,多种采血管采集时,最后使用PB采血管;仅用PB采血管时,先用另一个采血管采集1~2mL血样,丢弃该采血管,再使用PB采血管(作用:采血器容积能被预灌注,另减少血压造成的冲击力,一定程度上清洗采血管)

3、采血后,立即上下颠倒混匀十次左右,18~25℃正立放置2h

4、若不立即提取,将采血管正立置于塑料试管架上(注意:试管架与采血管之间需留有空隙,防止低温保存过程中管壁开裂),先于-20℃放置24h,然后转移至-80℃进行长期保存或转移至干冰中进行运输。

5、运输时请使用厚壁泡沫盒,放入充足的干冰,在样品保存及运输过程中应避免反复冻融。


全血的保存方式:

BD-PAXgeneTM Blood RNA Tube(含有抗凝剂,RNA稳定剂,作用:减少体外降解,将体外基因诱导作用降到最低),通常为静脉采血,采血量:2.5ml适用对象人和灵长类动物。

普通医用抗凝管(只含有抗凝剂),抗凝剂通常为:EDTA、柠檬酸钠,不允许使用肝素作为抗凝剂,因为肝素是PCR酶的活性抑制剂,会抑制下游实验的PCR反应。

冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNase,因此勿直接冻存新鲜血液,可在新鲜抗凝血中直接加入trizol裂解混匀,-80℃保存,避免反复冻融(trizol:血液=3:1),采样后一周内必须提取RNA。

注意:实验中发现,PB采血管保存的全血所抽提出来的RNA得率往往会低于普通抗凝管保存的全血所抽提出来的RNA,这是因为PB采血管在未采血前已经有6.9ml的添加剂在里面了,故而采血量最多只能容纳2.5ml,而普通的抗凝管里面只含有抗凝剂,且抗凝剂的量较少,所以同等体积的抗凝管,普通抗凝管的采血量会更高,因此普通抗凝管收集的全血中RNA丰度会更高。

二、常规样本——血清血浆采集

血清血浆采集:

血浆:是抗凝血液经离心分离得到的淡黄色透明液体。

血清:血液凝固析出的淡黄色透明液体。

血清与血浆的区别:血清中不含纤维蛋白等凝血因子。


注意:

①分离血清血浆应严格按照操作说明进行,操作需在1h内完成,避免出现溶血现象,血清血浆分离后避免反复冻融。

血清血浆送样量的原则:越多越好,如果手头上的血清血浆量较少,则有多少就送多少,通常该种类型的样本RNA含量较低,所以需要通过加大样本量以富集足够多的RNA,以保证后续实验的顺利进行,此外血清血浆RNA通常不质检。

③分离血清/血浆样本的全血不可冷冻,混入的血细胞尽量弃尽。

溶血现象:即因红细胞细胞膜的破裂而导致的红细胞破碎、血红蛋白溢出的现象。溶血可由多种物理或化学因素引起,尤其在人体外,渗透压的变化、机械外力,温度的变化,酸碱度的变化或血液处理的过程中人为添加的一些化学物质,均有可能引起不同程度的溶血。

应对策略:

(1)血液离开人体后,血液环境的稳定性与保存时间的长短呈反比,细胞膜的稳定性也在下降,在这种情况下,应尽快开展血清血浆的分离 。

(2)不同的抗凝剂有其不同的分子构型,会对血液中各细胞的细胞膜产生不同的作用,有的会增加细胞膜的稳定性,有的会降低细胞膜的稳定性,所以选择一款合适的抗凝剂至关重要(抗凝剂推荐:EDTA、柠檬酸钠) 。

(3)血液存放过程中温度过高或反复冻融对细胞膜有很大的损害。温度过高及反复冻融会使细胞膜上的结构蛋白构象发生改变,进而造成细胞膜的弹性降低以致破解产生溶血现象,所以用于分离血清血浆的血液应避免反复冻融。



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