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动物RNA抽提

作者:上海雅吉生物科技有限公司 2020-12-04T00:00 (访问量:2030)

 1. 样品的准备。
细胞样品:收集50-100万左右的细胞。对于悬浮细胞,1000-2000g离心1分钟后弃上清,加入300μl裂解液,轻轻吹打8-10次至固悬物溶解、溶液澄清;对于贴壁细胞,吸净培养液后加入300μl裂解液,轻轻吹打5-10次至固悬物溶解、溶液澄清,转移至一洁净离心管内。
组织样品:取15-20mg动物组织,置于液氮中研磨成粉末,立即加入600μl裂解液。也可将组织置于1.5ml离心管中,迅速加入600μl冰浴预冷的裂解液,用微型电动匀浆器匀浆,或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后,轻轻吹打匀浆液8-10次,室温放置3-5分钟。然后约14,000g离心2分钟,将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
注意:细胞的数量一般不超过500万,不超过100万细胞宜使用300μl裂解液,多于100万细胞宜使用600μl裂解液。动物组织的用量一般不超过30mg,用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后,离心管下部可能会有一些胶状物质,宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物,会导致得率下降约30-50%。后续加入结合液后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物,需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品,裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
2. 加入等体积结合液至裂解液中,轻轻颠倒混匀3-5次。此时可能会有沉淀物产生,属于正常现象。
3. 将混合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内,12,000g离心30秒,倒弃收集管内液体。
注意:当裂解液的体积大于300μl时,在加入等体积结合液后,总体积会超过纯化柱的容量,这时应分成2次过柱,即将一半的混合物过柱后,再将剩余的混合物重复步骤3一次。对于一些特殊的样品,如出现溶液未完全通过时,可延长离心时间至1-2分钟,或者加大离心力至16,000g。对于一些能快速启动达到12,000g的离心机,离心30秒已经足够,对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。
4. 加入600μl洗涤液I,12,000g离心30秒,倒弃收集管内液体。
5. 加入600μl洗涤液II,12,000g离心30秒,倒弃收集管内液体。
6. 重复步骤5一次。
7. 最高速(约14,000-16,000g)离心2分钟,去除残留的液体。
8. 将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中,加入30-50μl洗脱液,室温放置2-3分钟,最高速离心30秒,所得溶液即为纯化的RNA。
注意:
洗脱液需要加到纯化柱柱面中央,使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品,可把洗脱液的体积减小至20μl,但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时,洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外,洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次,可提高得率约10-30%;或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次,会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。

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